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1 種細菌型豆豉自然發(fā)酵過(guò)程中生物胺的變化

文章來(lái)源:未知 發(fā)布日期:2014-11-11 13:13:21作者:admin 點(diǎn)擊次數: 次
摘 要 利用丹磺酰氯為衍生試劑，1，7-二氨基庚胺做為內標驗證了《GB/T5009． 208 －2008》，以普通黃豆為原料，研究一定條件下細菌型豆豉自然發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮和生物胺的變化情況。研究發(fā)現，自然發(fā)酵的豆豉中生物胺有 8 種，分別為: 組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺、精胺。發(fā)酵 72 h 后 8 種生物胺中，酪胺含量達到 488 mg/kg，且從發(fā)酵 48 h 起，豆豉中酪胺的含量與氨基酸態(tài)氮的含量都存在著(zhù)先大幅增加再緩慢下降的趨勢。對照查閱國家相關(guān)規定，發(fā)現豆豉中主要具有毒性作用的組胺和酪胺沒(méi)有過(guò)國家允許范圍，因此理論上不存在危害生理健康的毒性。但應注意的是，由于組胺含量處于上升趨勢，細菌型豆豉自然發(fā)酵過(guò)程中要控制發(fā)酵時(shí)間，不然可能會(huì )因為組胺生成造成安全隱患。
豆豉是經(jīng)微生物發(fā)酵制成的調味副食品，以香誘人、風(fēng)味獨特而深受消費者的真愛(ài)。根據制曲發(fā)時(shí)參與的微生物種類(lèi)可分為毛霉型、曲霉型、細菌型及脈胞菌型豆豉。水豆豉主要是云、貴、山東一帶民間制作的家常豉，其微生物主要是枯草桿菌以及少量的微球菌乳酸菌，其工藝簡(jiǎn)單，就是將黃豆蒸熟后直接裝在袋子或者攤放在稻草上自然發(fā)酵，發(fā)酵完成后直接拌食。水豆豉自然發(fā)酵過(guò)程中微生物以細菌為主，發(fā)酵過(guò)程中易產(chǎn)生生物胺。生物胺是一類(lèi)含氮低分子質(zhì)量化合物的總稱(chēng)，按化學(xué)結構可分為脂肪族( 腐胺、尸胺、精胺、亞精胺) 、芳香族( 酪胺、苯基乙胺) 和雜環(huán)類(lèi)( 組胺、色胺)。人體內積累較高數量的生物胺時(shí)就會(huì )產(chǎn)生毒性作用，其中生物胺中毒性的是組胺和酪胺。
發(fā)酵食品中過(guò)量的生物胺會(huì )對機體健康造成不良的影響。YONGMEIL 等檢測了中國豆醬中的生物胺含量，豆醬中主要含有酪胺、組胺和亞精胺，不同發(fā)酵類(lèi)型品種生物胺有差別，生物胺生成量與樣品中氨基酸態(tài)氮含量呈現正相關(guān)，由此可以看出，可利用的游離氨基酸是微生物代謝產(chǎn)生生物胺的必要條件之一。張建華等檢測了納豆發(fā)酵過(guò)程中的生物胺，在發(fā)酵納豆樣品中檢測到亞精胺、精胺、腐胺、酪胺 4 種生物胺，其中亞精胺的含量占總生物胺的70% 左右，與人體有直接毒性的生物胺—酪胺含量低于 14 mg/kg，95% 以上的生物胺都是對人體沒(méi)有直接毒性的多聚胺。TANG T 等檢測了腐乳中生物胺的含量，同時(shí)比較了微生物發(fā)酵腐乳與酶制腐乳中生物胺含量的差別。腐乳中主要含有色胺、腐胺、組胺和酪胺，其平含量分別為 39. 0、34. 6、18. 2、21. 7mg / kg，β-苯乙胺、亞精胺和精胺含量較低。微生物發(fā)酵腐乳中生物胺總量( 129. 0 mg/kg) 低于酶制腐乳( 137. 7 mg/kg) ，腐乳中生物胺總量低于安全限量。
目前國內外對于毛霉型、曲霉型豆豉和以納豆為代表的細菌型豆豉的營(yíng)養成分和發(fā)酵工藝都進(jìn)行了較深入的研究，但國內對自然發(fā)酵過(guò)程中生物胺的變化研究甚少。且目前國際上對食品中的生物胺沒(méi)有統一的標準，少數國家也只對于食品中的部分生物胺作出了含量限定，現有的各項法規都只對魚(yú)類(lèi)及其制品中的組胺進(jìn)行了限定，因此對于食品中生物胺毒性和檢測技術(shù)的基礎研究，和生物胺限量標準的準確評估工作都是具有實(shí)際意義的。農村中，許多農戶(hù)都是將黃豆在自然條件下發(fā)酵，直接拌料進(jìn)行食用，本文以普通黃豆為原料，研究一定溫度、一定裝載量、不同發(fā)酵時(shí)間對細菌型豆豉自然發(fā)酵過(guò)程中生物胺及氨基酸態(tài)氮 2 個(gè)指標的影響及其相關(guān)性，為食品安全提供參考。
1 材料與方法
1. 1 原料與試劑
1. 1. 1 原料
黃豆、生姜、大蒜、桂皮、八角。
1. 1. 2 試劑
NaOH，鄰苯二甲酸氫鉀，甲醛，組 胺 鹽 酸 鹽 ( himstaminedihydrochlo-ride) 、β-苯乙胺 ( β-phenylethylamine ) 、酪胺鹽酸鹽( tyramine hydrochloride) 、腐胺( putrescine) 、尸胺( ca-daverine) 、5-羥色胺( serotonin) 、精胺( spermidine) 、亞精胺( spermine) 、色胺鹽酸鹽( tryptaminehydmchlo-ride) ， l，7 二氨基庚烷( 1，7-diaminohep-tane，內標) ，苯甲胺鹽酸鹽 ( benzylaminehydrochloride，內標) 、丹磺酰氯 ( dansylchloride) ， 甲醇、丙酮，色譜純; 乙醚( 重蒸) 、正丁醇、氯仿、HCl、三氯乙酸( TCA) 、NaCl、NaHCO3、谷氨酸鈉( 分析純) 、純水。
1. 2 主要儀器設備
TE212-L 電子天平; HH-數顯恒溫水浴鍋;pHS-25 型數顯酸度計; HJ-1磁力加熱攪拌器; DGG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱; 立式實(shí)驗型膠體磨; 高效液相色譜儀 HPLC 配紫外檢測器或二管陣列檢測器; 離心機( 4 000 r/min); 旋渦混合 器 ortex-2genie USA; 氮氣濃縮器( N-EVAPOＲATOＲ) ; Waters 高效液相色譜儀 e2695 配2489 紫外檢測器; 色譜柱 C18柱( 250 mm ×4. 6 mm，5 μm); 純水器B110-B; 微型旋渦混合儀 WH-2; 臺式低速離心機 TG16; 多用調速振蕩器 HY-4; 氮氣吹掃儀MD200; 電子分析天平AＲ2140; 生化培養箱 LＲH-300。
1. 3 實(shí)驗方法
1. 3. 1 細菌型水豆豉制作工藝流程
黃豆→清選→加水浸泡→蒸煮( 高壓 121 ℃、15min) →冷卻→前發(fā)酵( 37 ℃ 、不同時(shí)間) →直接拌料→成品。
1. 3. 2 試驗方法設計
以下操作為的黃豆浸泡條件: 泡豆水 pH8. 0，泡豆溫度常溫，豆量∶ 水量為1∶ 4( g∶ mL) ，泡豆時(shí)間 10 h。高壓 121 ℃、15 min 蒸熟，降溫到 45℃ 后，用 1 kg 的食品級包裝袋包裝發(fā)酵，平整后在包裝袋表面扎數個(gè)小孔，裝豆量800 g，發(fā)酵時(shí)間 72 ～120 h，發(fā)酵溫度為 37 ℃，稱(chēng)取發(fā)酵樣品，按48、72、96、120 h不同發(fā)酵時(shí)間，測定氨基酸態(tài)氮和生物胺含量，每個(gè)試驗重復 3 次。
1. 4 檢測方法
1. 4. 1 氨基酸態(tài)氮的測定
1. 4. 2 生物胺含量的測定
1. 4. 2. 1 標準溶液的配制及標準曲線(xiàn)制作
各生物胺標準品用 0. 1 mol/L HCl 溶液配制成質(zhì)量濃度為 1 mg/mL 的儲備液( 酪胺鹽酸鹽和二鹽酸組胺需折算掉鹽酸鹽) ，分別吸取相同體積的 8 種生物胺單組分置于同一個(gè)容量瓶中，配制成 100 mg/L的生物胺標準混合使用液。溶液避光保存于4 ℃ 冰箱中。
將混合使用液配制成一定濃度的標準系列，標準系列 的 濃 度 為: 2. 50，5. 00，10. 00，15. 00，25. 00，50. 00 mg / L。分別吸取 0. 5 mL 生物胺標準系列溶液進(jìn)行生物胺衍生化。為確定生物胺混合標準品的出峰順序，配制成 40 mg/L 的 8 種單一生物胺標準品，可由生物胺標準品圖譜的保留時(shí)間來(lái)確定每種生物胺。
1. 4. 2. 2 生物胺的提取和衍生生物胺的提取和衍生依據《GB/T 5009. 208 －2008 食品中生物胺含量的測定》
準確稱(chēng)取絞碎后的豆豉樣品 10. 00 g，置 100 mL 具塞錐形瓶中，加入20 mL 5% 三氯乙酸溶液，和 2. 0 mL( 100 mg / L) 內標使用液，混勻，振蕩提取 60 min，轉至 50 mL 離心管中，3 600 r/min 離心 10 min，取上清液，置 50 mL 容量瓶中，連續提取 2 次，合并上清液，用 5% 三氯乙酸稀釋至刻度，濾紙過(guò)濾。
將上述溶液加入適量 HaCl 至飽和，準確移取該飽和液 5. 00 mL，置于 15 mL 離心管中，用 0. 1 mol/L的 NaOH 溶液調節 pH 至 12. 0，加入 5. 0 mL 正丁醇-三氯甲烷混合液( 1 +1) ，渦旋振蕩5 min，3 600 r/min離心10 min，取上層有機相，再重復萃取 2 次，后一步萃取用分液漏斗分離，合并萃取液，混勻，取3. 0 mL萃取液并加入 0. 2 mL 1 mol / L HCl，混合后40℃ 水浴下氮氣吹干，加入 1. 0 mL 1mol / L HCl 使殘留物溶解，待衍生。
取經(jīng)過(guò)提取，凈化、萃取后的樣液 0. 5 mL，置于10 mL 具塞試管中，加入 1. 5 mL NaHCO3飽和溶液、1. 0 m 丹磺酰氯衍生溶液，振蕩使混勻。置 60 ℃ 培養箱中反應 30 min，中間振蕩 2 次，取出，分別加入100 μL 谷氨酸鈉( 50 mg / mL 飽和 NaHCO3溶液) ，振蕩混勻，60 ℃中保溫 15 min。取出，每個(gè)試管中加入1 mL 純水，40 ℃ 水浴下用氮氣出去丙酮。加入3 mL乙醚，振蕩 2 min，靜置分層后吸取出上層有機相( 乙醚層) ，重復萃取 2 次，合并乙醚萃取液，氮氣吹干，加入 1. 0 mL 甲醇使殘留物溶解，振蕩混勻，0. 22 μm 濾膜針頭濾器過(guò)濾，濾液待測。
樣品衍生后，依據《GB/T 5009. 208 － 2008 食品中生物胺含量的測定》上機測定。為了使各種生物胺的保留時(shí)間縮短，而響應值高，分離度高，改變了色譜條件: 將 1. 5 mL/min 流速改為 1. 0 mL/min。
1. 4. 2. 3 精密度的測定
取濃度為 25. 00 mg/L 的混合標準溶液衍生樣品，平行進(jìn)樣 7 次，根據測定結果計算相對標準偏差ＲSD。
1. 4. 3 對照樣品分析
樣品來(lái)源: 購買(mǎi) 3 個(gè)不同品牌商品發(fā)酵豆豉測定其中 8 種生物胺的含量。生物胺的提取: 樣品經(jīng)研磨充分后，取樣，用三氯乙酸提取，將試樣除脂肪、萃取進(jìn)行凈化，然后進(jìn)行生物胺的衍生反應，樣液待測。
1. 4. 4 數據處理
數據利用 Excel 表格進(jìn)行分析。
2 結果與分析
2. 1 標準樣品和實(shí)際樣品圖譜
相較國標方法 30min 生物胺衍生物洗脫出來(lái)，整個(gè)梯度洗脫結束為45 min，更改流速和調整洗脫程序后 28 min 內生物胺衍生物被洗脫出來(lái)，洗脫程序結束時(shí)間為32 min，提前了 13 min，節省了樣品分析時(shí)間，在實(shí)際檢驗分析工作中有很重要的意義，且各生物胺衍生物分離效果好，峰形對稱(chēng)，無(wú)雜質(zhì)干擾，因此該流動(dòng)相梯度是可行的。8 種單一生物胺衍生物分析結束后，確定混合標準溶液 8 種生物胺衍生物的出峰順序為: 組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺、精胺。
2. 2 實(shí)驗方法的驗證
8 種生物胺的含量在 2. 5 ～ 50 mg / L 時(shí)，其回歸方程Ｒ2大于等于 0. 992 8 ，可以滿(mǎn)足生物胺檢測的需求。
2. 3 精密度
2. 4 前發(fā)酵過(guò)程中生物胺的變化
選取不同時(shí)間梯度對豆豉中生物胺含量的測定結果，從發(fā)酵豆豉中共檢測到8 種生物胺。樣品中含有 β-苯乙胺含量、尸胺、腐胺、酪胺、亞精胺、精胺。不同樣品中生物胺種類(lèi)及總量有差異。發(fā)酵水豆豉中生物胺含量的顯著(zhù)差異與原料裝載量、發(fā)酵或儲存時(shí)間有關(guān)。提取上表中酪胺、尸胺、組胺的數據繪制成折線(xiàn)圖，與不同發(fā)酵時(shí)間氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行比對。從發(fā)酵 48h 起，豆豉中氨基酸態(tài)氮含量存在著(zhù)先大幅增加再緩慢下降的趨勢，由于是自然發(fā)酵，所以隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)細菌繁殖，可能有脫羧酶的微生物參加，而導致氨基酸態(tài)氮出現后期下降的現象。
豆豉中酪胺的含量與氨基酸態(tài)氮的含量變化存在著(zhù)性，這也從一定程度上反映了和驗證了之前關(guān)于氨基酸態(tài)氮是生物胺產(chǎn)生的條件之一的說(shuō)法。發(fā)酵初期豆豉中的游離氨基酸含量越高，產(chǎn)生生物胺的可能性就越大。而尸胺含量在發(fā)酵 72 h 隨著(zhù)氨基酸態(tài)氮含量的增加達到值，之后驟降到相對穩定的較低值。組胺含量從發(fā)酵 48 h 起逐漸上升，雖然沒(méi)有在含量上明顯表現出和氨基酸態(tài)氮的性，但是其含量的上升可能消耗了游離氨基酸而導致了氨基酸態(tài)氮后期的緩慢下降，因此細菌性豆豉自然發(fā)酵過(guò)程中要控制發(fā)酵時(shí)間，不然可能會(huì )因為組胺生成造成安全隱患。
2. 5 對照材料中生物胺的含量
所測定樣品中未檢出精胺和亞精胺。臘八豆含有 4 種生物胺，但是含量較低;豆鼓的生物胺含量較低，種類(lèi)少，油辣椒豆豉生物胺含量，僅含有少量的色胺。色胺能夠引起高血壓，然而許多國家都沒(méi)有對色胺制定限量標準。
與自然發(fā)酵細菌性豆豉工藝比較，豆豉、臘八豆一般采用接種米曲霉或者毛霉發(fā)酵，加上有油炸或炒制工藝和其他配料，這類(lèi)產(chǎn)品中生物胺的含量較低。
來(lái)源：惠合膠體磨研磨設備廠(chǎng)
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